ВЛИЯНИЕ УФ-Б РАДИАЦИИ НА ОБРАЗОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КАЛЛУСНЫМИ КУЛЬТУРАМИ Triticum aestivum
Лапшин П.В., Загоскина Н.В.
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия, (095)977-94-33, E-mail: phenolic@ippras.ru

В последние десятилетия внимание ученых многих стран мира обращено на возрастание доли коротковолной части радиации, а именно УФ-Б лучей (280-320 нм), в атмосфере нашей Планеты. Это является следствием техногенной деятельности человечества, приведшее к увеличению содержания в ней антропогенных соединений и снижению концентрации газа озона (О3). Последний же является основным протектором проникновения УФ-Б излучения к поверхности Земли (1).

Ультрафиолетовое излучение (УФ) является мощым стрессорным фактором для всех живых систем, в том числе и растений (2). Под его воздействием изменяются многие морфо-физиологические, генетические и биохимические параметры растительных клеток (3,4). Известно его мутагенное действие на все живые организмы (5). При этом изменения, происходящие в растительных клетках действием УФ-Б лучей зависят от вида ткани, стадии развития организма, его генотипа, а также длительности облучения (6).

В качестве защиты от негативного действия больших доз природного ультрафиолетового излучения, растения выработали ряд приспособительных механизмов. Одним из них является синтез фенольных соединений, обладающих способностью поглощать коротковолновую часть спектра солнечной радиации (7). При этом, степень повреждающего действия ультрафиолетового облучения зависит от уровня накопления в них антоцианов, флавоноидов и других соединений фенольной природы, а также от индукции их образования (8). Было показано, что фенольные соединения, в частности флавоноиды и антоцианы, накапливались преимущественно в эпидермальном слое растительной ткани, который таким образом защищает растения от действия ультрафиолета (9).

Удобным подходом для изучения действия различных стрессовых факторов на растительные клетки являются клеточные культуры растений. Известно, что растительные клетки тотипотентны и в условиях in vitro они сохраняют многие свойства интактного растения, в том числе и способность к синтезу фенольных соединений (10). Именно клеточные культуры позволили выяснить некоторые аспекты участия фенольных соединений в защите клеток, в том числе и от действия УФ-Б радиации (11). В настоящее время известно, что УФ-Б лучи повышают активность ферментов фенилпропаноидного пути синтеза фенольных соединений, в частности фенилаланинаммиак-лиазы и халкон-синтезы (12). Это, в свою очередь приводит к увеличению количество фенольных соединений в клетках, а, следовательно, и повышению их устойчивости к УФ-Б радиации (13).

В тоже время в литературе отсутствуют данные о том, сохраняются ли изменения в фенольным метаболизме после прекращения действия УФ-Б радиации на клетки растений. Именно этот аспект и являлся целью настоящего исследования.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объектом исследования являлись каллусные ткани полученные из незрелых зародышей яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum линии Фотос (Л 40959) Башкирского НИИЗиС. Культуры выращивали на модифицированной агаризованной питательную среду с минеральными солями по рецепту Мурасиге и Скуга с добавлением витаминов: глицина (2мг/л), никотиновой к-ты (0,5 мг/л), пиридоксина-HCl (0,5 мг/л), тиамина-HCl (1 мг/л), мезоинозита (100 мг/л), аспарагина (150 мг/л), аскорбиновой к-ты (20 мг/л); 10мг/л AgNO₃, и 2,5 мг/л 2,4-Д. Сахароза присутствовала в среде в концентрации 2%. pH среды корректировался в пределях 5,6-5,8. Ткани выращивали в камере фитотрона, при 20оС и освещенности ~5KLx. Первичный и пересадочный каллус подвергали селекции, используя для этого аналог ртутной лампы ПРК-2, в сочетании со стеклянными чашками фирмы "Anumbra", убирающими УФ-С излучение. Для биохимического анализа использовали каллусные линии, отобранные после селекции при интенсивности облучения 0, 39 или 0,55 Вт/м² по УФ-Б. Контрольная ткань находилась под стеклом, непрозрачным для ультрафиолета.

Фенольные соединения экстрагировали их свеже-замороженных каллусов экстракцией 96%-ным этанолом. Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений в этанольных экстрактах проводили спектрофотометрическим методом с реактивом Фолина-Дениса (14).

Изучение фенольного комплекса каллусных культур проводили методом хроматографии в тонком слое микрокристаллической целлюлозы в системе н-бутанол—уксусная кислота—вода (49:12:28, по объему). Идентификацию соединений проводили на основании данных по их флуоресценции в ультрафиолете, по значениям Rf сравнительно с метчиками, по качественным реакциям с FeCl₃ и K₃[Fe(CN₆)]) (15).

Содержание свободных аминокислот определяли с помощью автоматического анализатора аминокислот (ААА-339М, фирма "Kovo", Чехия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Каллусные культуры пшеницы, полученные в результате селекции при различных интенсивностях действия УФ-Б радиации и в дальнейшем культивируемые в обычных условиях, практически не отличались по морфо-физиологическим характеристикам (16). Все они представляли собой рыхлые каллусы светло-желтого цвета с небольшим количеством меристематических очагов. По содержанию в них фенольных соединений полученные каллусные линии отличались друг от друга ( табл. 1).

Таблица 1

Наиболее низкий уровень фенольных соединений характерен для культуры, растущей в обычных условиях и не подвергавшейся действию УФ-Б лучей (контроль). Во всех остальных линиях, полученных в результате селекции к УФ-Б, содержание этих веществ было выше (2,5- 5 раз). Наибольшее накопление фенольных соединений отмечено у линии В5. Во всех же остальных случаях уровень этих веществ был довольно близок. Следовательно, судя по полученным данным, изменения в биосинтетической способности клеток каллусных культур пшеницы в отношении синтеза фенольных соединений почти не зависят от интенсивности УФ-Б облучения. Исключением являлась лишь линия В5, для которой характерна высокая способность к образованию фенольных соединений. Вероятно это связано со значительными изменениями в ее генетических характеристиках, обусловленные, по-видимому, мутагенным действием УФ-Б лучей, как это неоднократно отмечалось в литературе (2).

Важным моментом для понимания метаболических процессов, происходящих в растительных клетках, является изучение состава синтезируемых в них веществ, в том числе и фенольной природы. Изучение фенольного комплекса каллусных культур показало присутствие в нем 4-8 соединений (рис. 1).

Рис. 1. Одномерная хроматограмма этанольных экстрактов линий каллусных культур пшеницы, полученных в процессе селекции в условиях действия УФ-Б радиации (представлены соединения фенольной природы, реакция с хлорным железом и красной кровяной солью).

Более простой состав фенольных соединений характерен для линий Н₁ и В₄. В остальных же случаях состав фенольных соединений был более разнообразен и во многом идентичен. Судя по предварительным данным, в каллусных культурах пшеницы синтезируется преимущественно фенилпропаноиды, являющиеся одними из наиболее распространенных в растениях представителей фенольного метаболизма.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что условия УФ-Б радиации способствуют активации синтеза фенольных соединений в каллусных культурах пшеницы, как это отмечалось и другими исследователями (13). При этом, интенсивность этих изменений, по-видимому, зависит от генетических характеристик клеток, полученных в результате селекции. В целом же значительных изменений в качественном составе синтезируемых фенольных соединений не наблюдается. Все это свидетельствует о том, что УФ-Б лучи вызывают главным образом активацию фенольного метаболизма в клетках растений и мало влияют на их метаболические пути.

Литература:

1. Frederick J.E., Snell H.E., Haywood C.//Photochem. Photobiol. 1989. V. 50. P. 443.
2. Фрайкин Г.Я.//Физиология растений. 1987. Т. 34. С. 712.
3. Шульгин и др.//Биол. Науки. 1990. № 7. С. 712.
4. Tevini M., Iwanzik N., Thoma U. // Planta.1981. V. 153. P. 388
5. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. 1978. М. Мир.
6. Caldwell C.R. //Photophysiology. 1971. V.6. P.131.
7. Запрометов М.Н. Фенольные соединения. 1993. М. Наука.
8. Hashimoto T., Shichijo C., Yatsuhashi H.// Photochem. Photobiol. 1991. V. 11. P. 353-363.
9. Tevini M., Braun J., Fieser G. //Photochem. Photobiol. 1991. V. 53. P. 329.
10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. 1999. Москва. ФБК-Пресс.
11. Marphy T. et al.//Plant Physiol. 1979. V.64. P.936.
12. Bruns B., Hahlbrock K., Schafer E.//Planta. 1986. V. 169. P. 393.
13. Загоскина Н.В. и др.//Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 302.
14. Запрометов М.Н.// Биохимические методы в физиологии растений. 1971. М. Наука.
15. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. 1975. М. Наука.
16. Лапшин П.В., Бутенко Р.Г.// Изв. ТСХА. 2001. № 3. С. 20.

    Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 04-04-49408.