КАУДИЦИФОРМНОЕ РАСТЕНИЕ - СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ IN VITRO
Лапшин П.В., Осипова Е.А., О.В.Решетняк
докл. на конф. Первая научно-практическая конференция "БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ИНТРОДУКЦИЯ СУККУЛЕНТОВ", Санкт-Петербург, 8-10 октября 2004 г.

Stephania glabra (Roxb.) Miers. (син. S. rotunda Lour.; S. japonica Miers var. glabra), сем. луносемянниковые (Menispermaceae Juss.). Цель работы - получение линии Stephania glabra в суспензионной культуре, с высоким уровнем синтеза ценного для медицины алкалоида стефарина. Стефания гладкая - двудомная многолетняя лиана с крупным, почти круглым стеблеклубнем (каудексом) диаметром до 50 см, массой до 30-50 кг, расположенным у поверхности почвы. Стебли длиной до 15 м и более, вьющиеся, с возрастом у основания древесневеющие. Листья очередные, округлые, остроконечные, гладкие; до 15-20 см. Цветки зеленовато-желтые в зонтиковидных свисающих соцветиях. Произрастает в субтропических и тропических областях Юго-восточной Азии: южный Китай, Индия, предгорья Гималаев, в Японии. Была интродуцирована в субтропиках Закавказья: с 1958 году в Аджарии на Черноморском побережье Кавказа. Стефания гладкая - одно из самых высокоалкалоидных растений земного шара. В ее стеблеклубнях содержится до 6-8% алкалоидов: гиндарин, 2% (и его производные: гиндаринин и гиндаридин), стефаглабрин (или стефарин), циклеанин, ротундин и др. Клубни и зеленая масса применяется в народной и официальной медицине. Фармакологическая активность стефании гладкой зависит от содержания алкалоидов гиндарина и стефаглабрина. Стефаглабрин обладает антихолинэстеразной активностью; ингибирует холинэстеразу. Гиндарин обладает седативным и спазмолитическим действием.

Культура in vitro Stephania glabra была получена в Институте лекарственных растений (ВИЛАР). Эксплант — ткани стеблеклубня взрослого растения. Разработка системы селекции in vitro проводилась в ИФРе. Клеточные линии получали как обычным клонированием, так и с парафторфенилаланином. В результате Е.А.Осиповой были получены линии с уровнем синтеза стефарина порядка 0,4-0,6%. Одна из этих линий, 86-МФ, поддерживалась в дальнейшем в течение 7 лет, за это время уровень синтеза у нее постепенно снизился до 0,15%. Настоящая работа ставит своей целью восстановить линии Stephania glabra с высоким синтезом стефарина в суспензионной культуре для передачи в производство. Методика получения клеточных линий была такова: суспензию исходной линии 86МФ высевали на агаризованную среду, получали каллусные колонии, которые культивировали 1-3 пассажа, вводили их обратно в суспензию и анализировали содержание стефарина. Суспензия визуально сравнительно гомогенная и мелкоагрегированная, часто с включением крупных агрегатов, коричневато-красноватого или коричневато-серого цвета, иногда с розоватым оттенком или черно-серая. Наблюдали заметные различия между линиями. Содержание алкалоидов определяли на 14-е сутки культивирования, сравнивая интенсивность полос на хроматограмме вытяжки из сухой ткани (0,1% H₂SO₄) между разными клеточными линиями и контрольной пробой (0,2% р-р сульфата стефарина).

За два года работы в общей сложности было получено и проанализировано 161 клеточная линия. Из них после первичного качественного анализа выделили 76 линий. Количество синтезируемых алкалоидов в этих линиях оценивали денситометрическим методом О.В.Решетняк. При дальнейшем поддержании этих линий, к сожалению, в большинстве случаев отмечали быстрое снижение синтеза алкалоидов. В данный момент поддерживаются 6 лучших линий с содержанием стефарина от 0,2% до 0,4% на сухую массу. Самая перспективная линия - «254». Для нее снимали динамику роста и синтеза в ходе цикла выращивания, в т.ч. при разной плотности пересева. Оценивали конечную плотность суспензии; сухую массу и индекс роста. При сравнении исходной линии «86МФ» и полученной «254», плотность последней была в полтора раза выше и эта линия характеризуется укороченным циклом и ранним максимумом синтеза стефарина. В настоящее время отслеживается уровень синтеза стефарина у отобранных линий в пассажах.