МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ДЕЙСТВИЮ УФ-Б РАДИАЦИИ
П.В.Лапшин, Н.В.Трошенкова, Г.А.Дубравина*, Н.В.Загоскина*, Р.Г.Бутенко*
Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева, кафедра сельскохозяйственной биотехнологии;
*Институт фзиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва, 123276, Ботаническая 35

Воздействие достигающей поверхности Земли ультрафиолетовой области солнечной радиации (УФ-радиации) на растительные объекты привлекает пристальное внимание ученых в связи с изменением состояния озонового слоя атмосферы [4, 8]. Значительное его утоньшение отмечено для многих континентов планеты [4], что является следствием техногенных процессов [17]. Это, в свою очередь, приводит к тому, что на поверхности Земли возрастает уровень излучения в диапазоне длин волн от 280 до 320 нм, который относится к ультрафиолетовой области спектра , а именно - к его "среднему" или "Б"-участку, обозначаемому как как "УФ-Б радиация" [4, 8]. Именно озон поглощает практически всю УФ-радиацию ниже 280 нм [6].

УФ-радиация является одним из сильных стрессовых факторов окружающей среды, и понимание того, каким образом живые организмы реагируют на него, позволит оценить опасность ее воздействия. Показано, что УФ-радиация вызывает морфо-физиологические изменения у растений. Она снижала линейный рост стебля, уменьшала коэффициент кущения и число колосоносных побегов у пшеницы [19]. У проростков картофеля увеличение продолжительности ежедневного действия УФ-Б радиации приводило к уменьшению высоты стебля и поверхности листьев [5]. При этом эффекты действия УФ-Б радиации зависели от стадии роста растений. Наибольшая чувствительность к действию радиации отмечалась при переходе от вегетативной и репродуктивной стадии развития [9, 10, 14]. Отмечено также изменение гормонального статуса растений при действии УФ-Б радиации. Так, например, у растений арабидопсиса отмечалось увеличение накопления абсцизовой кислоты [15]. Все это приводит к образованию растений с заторможенным ростом, плохой пигментацией и нарушениям формирования листового аппарата. Это, в свою очередь, отражалось и на функционировании их фотосинтетического аппарата. При этом фотосистема II более чувствительна к действию УФ-Б радиации, чем фотосистемы 1. Это обусловлено тем, что УФ-облучение подавляет фотохимическую активность фотосистемы II, вызывая уменьшение потока электронов между фотосистемами [18].

Ультрафиолетовые лучи индуцируют также различные повреждения ДНК, при этом пиримидины в 10 раз более чувствительны к действию ультрафиолета, чем пурины [11]. Ультрафиолетовое излучение, действуя на ДНК, может также индуцировать большое число хромосомных аберраций в клетках растений [3]. Все это может быть причиной повышения уровня мутаций в растительных клетках, что, в свою очередь, негативно сказывается на сохранении генофонда живых организмов.

В связи этим изучение действия УФ-Б радиации на растительные объекты и получение устойчивых к этому фактору культур имеет важное народно-хозяйственное значение.

Основной зерновой культурой сельского хозяйства России является пшеница, с которой давно ведется селекционная работа с использованием традиционных подходов. В последнее время все более широкое применение находят также и биотехнологические приемы на основе селекции растительных клеток в условиях in vitro [12]. Такой подход существенно ускоряет селекционный процесс в силу реализации свойственной растительной клетке тотипонентности.

В связи с этим, целью настоящего исследования являлось получение каллусных культур пшеницы, обладающих повышенной устойчивостью к действию ультрафиолетового облучения и изучение их морфо-физиологических характеристик.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали каллусные культуры, инициированные из двух генотипов яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum - сорта Таежная и линии Фотос.

Сорт Таежная был выведен в Красноярском НИИСХ методом индивидуального отбора из третьего поколения гибридной комбинации К-441 (Л-330 х М-341). Разновидность лютесценс. Достоинством сорта является скороспелость (созревает раньше стандарта на 2-11 дней), устойчивость к полеганию (оценивается в 4,9 балла, выше стандарта на 1,3 балла) и к прорастанию на корню и в валках. Дает семена с высокой послеуборочной всхожестью.

Линия Фотос (Л 40959) была получена индивидуальным отбором из гибридной популяции от скрещивания сортов Московская 35 и Жница в Башкирском НИИЗиС. Разновидность мильтурум. По качеству зерна относится к ценным пшеницам. Линия устойчива к полеганию, среднеранняя - созревает одновременно с сортом Жница (вегетационный период - 85-90 дней). Проявляет высокую устойчивость к поражению мучнистой росой и бурой ржавчиной, пыльной головней поражается слабо. Обладает хорошей комбинационной способностью.

Для инициации каллусной ткани семена пшеницы стерилизовали 0,1% сулемой в течение 10 минут, заливали небольшим количеством стерильной воды и через 16-24 часа вычленяли из них зародыши. Материал помещали в чашки Петри диаметром 9 см по 12-18 штук, щитком вниз, на поверхность модифицированной агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга [7], содержащей 2,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 10 мг/л AgNO₃ и культивировали при температуре 20-22^oС и 16-час. фотопериоде (интенсивность освещенности 4000 люкс). Длительность пассажа составляла 28 дней.

В качестве источника УФ-Б радиации использовали лампу ДРЛФ-400 с удаленной внешней колбой, являющейся эквивалентом бактерицидной ртутной лампы высокого давления типа ПРК-2 (ДРТ). Для селекции клеточных линий пшеницы устойчивых к действию УФ-Б радиации растительный материал культивировали в стеклянных чашках фирмы "Anumbra" (Германия), не пропускающих излучение ниже 280 нм.

Интенсивность облучения (1,66; 1,11; 0,74; 0,55; 0,46 и 0,39 Вт/м² по УФ-Б) регулировали изменением расстояние чашек с культурами от лампы. Время облучения составляло по 2 часа каждый день (с 16 до 18 час.). Контрольные варианты были изолированы от лампы обычным стеклом.

Исследовалось действие УФ-Б на процесс каллусообразования, интенсивность роста и регенерационную способность неорганизованно растущей каллусной ткани яровой мягкой пшеницы T. aestivum сорта Таежная и линии Фотос, а также на морфологические характеристики клеточных линий.

Анализировали прирост каллусной массы путем индивидуального взвешивания каллусных агрегатов в стерильных условиях на торсионных весах в момент очередного пассирования. Результаты оценивали в конце каждого пассажа по количеству образовавшихся каллусов из первичного экспланта и по их массе, которая учитывалась индивидуально для каждого экспланта, что позволило выделить клеточные линии, ведущие свое происхождение от одного первичного экспланта.

Для изучения морфологии клеток каллусные ткани замораживали, используя для этого микротом-криостат, готовили тонкие срезы, которые сразу же окрашивали малахитовым зеленым [16]. Анализировали размеры клеток и толщину клеточных стенок на микроскопе "Ergavall" (Германия) с помощью окуляр-микрометра.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для осуществления поставленной задачи необходимо получить растущие в условиях in vitro каллусные культуры пшеницы обладающие устойчивостью к действию УФ-Б радиации. Для этого каллусные ткани выращивали в условиях УФ-облучения в течение ряда субкультивирований, а затем был произведен отбор устойчивых клеточных линий.

Каллусные культуры пшеницы (сорт Таежная и линия Фотос) представляли собой агрегаты светло-желтого цвета, никогда не зеленеющие, плотные, часто с выраженной внутренней структурой, обычно нескольких, хорошо различимых типов, соотношение которых зависело от условий культивирования, возраста культуры, частоты пассирования и индивидуальной массы каллусных агрегатов.

УФ-Б радиация (1,66 и 0,74 Вт/м² по УФ-Б) негативно влияла как на интенсивность формирования каллусов на эксплантах, так и на их массу (табл.1, рис. 1). При этом у линии Фотос интенсивность каллусообразования в условиях действия УФ-Б радиации была почти в три раза ниже, чем в контроле (табл.1). У сорта Таежная эти изменения были выражены в значительно меньшей степени. Следовательно, изученные генотипы отличались по ответной реакции на действие УФ-Б радиации.

Рис.1. Интенсивность каллусообразования и прирост массы у каллусов яровой мягкой пшеницы сорта Таежная и линии Фотос при действии различных доз УФ-Б радиации.

Ингибирующее действие радиации прослеживается и при определении массы сформировавшихся каллусов. При этом у обоих генотипов увеличение дозы УФ-Б сопровождалось линейным снижением этого показателя (табл.1). Так при интенсивности 1,66 Вт/м² по УФ-Б масса каллуса линии Фотос составляла в среднем 51,2% от контроля, а Таежной - 45,0%. А при интенсивности 0,74 Вт/м² - 65,3% и 64,2% соответственно.

Таким образом два изученных генотипа пшеницы отличались по реакции на действие УФ-Б радиации. У линии Фотос облучение в большей степени влияло на инициацию каллусов и в значительно меньшей степени на последующий их рост. У сорта Таежная процент каллусообразования в присутствии УФ-Б оставался довольно высоким, тогда как масса образовавшихся калусов была ниже, чем у линии Фотос (при одинаковой дозе радиации).

Аналогичные закономерности отмечались и при более длительном действии УФ-Б радиации на каллусные культуры (рис. 2). Так, каллусная ткань выращиваемая в контрольных условиях или в условиях облучения интенсивностью 0,74 Вт/м² по УФ-Б сохраняла жизнеспособность и имела индекс роста порядка 2,1-2,6. В то время как каллусы, выращиваемые при более высокой интенсивности облучения (1,66 Вт/м² по УФ-Б) прекращали рост в течение первого месяца культивирования. При это культуры инициированные из сорта Таежная имели несколько больший прирост каллусной массы и индекс роста, чем культуры инициированные из линии Фотос.

Рис. 2. Влияние длительного воздействия различных доз УФ-Б радиации на рост каллусных культур яровой мягкой пшеницы сорта Таежная и линии Фотос.

При дальнейшем культивировании выяснилось, что выбранные дозы оказались летальными для обоих генотипов, поскольку наблюдалось только образование первичного каллуса из тканей экспланта. При их дальнейшем культивировании в контрольных условиях (без облучения УФ-Б) прироста каллусной массы не наблюдалось, хотя по внешнему виду культуры сохраняли характерный для живой ткани светло-желтый цвет и консистенцию. Кроме того УФ-Б радиация полностью блокировало морфогенетические процессы в культурах. В результате этого в последующих опытах условия селекции были несколько изменены - уменьшена общая доза радиации и введена более дифференцированная шкала (1,11; 0,74; 0,55; 0,46 и 0,39 Вт/м² по УФ-Б). Было выяснено, что доза 1,11 и 0,74 Вт/м² УФ-Б оказывала летальное действие на каллус сорта Таежная: после месяца культивирования при облучении сохранили рост 22,7% экспланта, после второго месяца - 0% (рис.2). При дозе 0,55 Вт/м² после 2 субкультивирований были выделены 11,2% жизнеспособных колоний, которые давали высокий прирост массы. Линия Фотос оказалась менее подверженной действию УФ-Б. Даже при дозе 1,11 Вт/м² по УФ-Б наблюдался некоторый прирост массы - 27,6% после 1 месяца и 18,9% после второго (рис.2).

В результате проделанной работы для линии Фотос удалось выделить несколько клеточных линий, способных сохранять рост на уровне контроля в присутствии УФ-Б радиации. Изучение морфологических характеристик показало, что все культуры состоят из клеток паренхимного типа имеющих крупную вакуоль, занимающую большую ее часть (рис.3). Размеры клеток и их структура у полученных в результате селекции линий и контрольных вариантов каллусных культур несколько отличались. Так, у культур подвергнутых действию УФ-Б радиации размеры клеток были несколько меньше (табл.2), а толщина клеточных стенок больше (табл.3) по сравнению с контролем. Следует также отметить, что чем выше доза действия УФ-Б радиации на культуры, тем толще их клеточные стенки.

Рис 3. Каллусная культура пшеницы линии 60/5. Окрашивание малахитовым зеленым. Возраст ткани 20 дней.

Рис 4. Меристематические очаги в каллусной культуре пшеницы (окрашивание флорглюцином).

Рис 5. Трахеидальные элементы в каллусной культуре пшеницы (окрашивание малахитовым зеленым).

Помимо паренхимных клеток в каллусных культурах довольно часто наблюдалось формирование меристематических очагов. Более интенсивно этот процесс происходил в контрольных вариантах, а также в культурах, полученных в результате селекции в условиях действия низких доз УФ-Б радиации. Меристематические клетки обычно имели округло-овальную форму, густую цитоплазму, крупное ядро и тонкую клеточную стенку (рис.4). Во многих линиях встречались также и трахеидальные элементы (как на начальной стадии формирования, так и в виде сосудистых пучков) (рис.5).

Все это свидетельствует о том, что УФ-Б радиация вызывает изменения в морфо-физиологических характеристиках клеток пшеницы, выращиваемых в условиях in vitro. В первую очередь, это подавление роста - растяжением и, как следствие, утолщение клеточных стенок, а, во-вторых, ослабление уровня внутритканевой дифференциации. Из этого мы можем заключить, что реакция клеток пшеницы, выращиваемых в условиях in vitro, на действие УФ-Б радиации в определенной степени аналогична таковой интактных растений [19], что свидетельствует о перспективности использования таких биотехнологических подходов с целью ускорения селекционного процесса в отношении важнейших для России сельскохозяйственных культур, в том числе и пшеницы.

ВЫВОДЫ

• разработана схема клеточной селекции пшеницы на устойчивость к действию УФ-Б с использованием искусственного источника излучения;
• показана возможность получения клеточных культур пшеницы, сохраняющих способность к росту в присутствии УФ-Б радиации;
• установлена зависимость роста клеточных культур пшеницы от интенсивности и длительности действия УФ-Б радиации;
• УФ-Б радиация вызывает изменения в морфо-физиологических характеристиках каллусных культур пшеницы, преимущественно в их клеточной структуре и уровне внутритканевой дифференциации.