| Список статей | Контакт с автором | English | RUS=Win1251 |
ОБРАЗОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ ТРАНСПОРТ В КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ ПОДВЕРГНУТЫХ ДЕЙСТВИЮ УФ-В РАДИАЦИИ
Загоскина Н.В., Алявина А.К., Гладышко Т.О., Лапшин П.В., Е.А. Егорова, Н.Г. Бухов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия, (095)977-94-33, E-mail: phenolic@ippras.ru
Характерной особеностью высших растений является способность к синтезу разнообразных соединений вторичного метаболизма, представленных алкалоидами, стероидами, терпеноидами и фенольными соединениями [1]. Фенольные соединения чрезвычайно широко распространены в растительном мире и являются обязательными компонентами не только каждого растения, но и каждой растительной клетки. Они участвуют в процессах фотосинтеза и дыхания, являясь компонентами электронтранспортных цепей митохондрий и хлоропластов, обеспечивают прочность растительных тканей и клеток, за счет отложения в клеточных стенках полимера фенольной природы лигнина, а также защищают от действия некоторых стрессовых факторов [2-4]. В частности установлена протекторная роль фенилпропаноидов и флавоноидов от коротковолнового УФ–излучения в отношении фотосинтетического и генетического аппарата клеток растений [2, 5].
Эта область солнечной радиации (280-320 нм) является для растений одним из сильных стрессовых факторов окружающей среды [6] Она подавляет их рост, изменяет гормональный статус, нарушает формирование листового аппарата, в том числе структуру хлоропластов, а также влияет на синтез фенольных соединений [7-10]. В то же время до сих пор нет ясности в вопросе о действии УФ-В радиации на функционирование фотосистем растительных клеток и, как следствие, на накопление в них фенольных соединений, от которых в значительной степени зависит устойчивость растений к УФ лучам.
Удобным объектом для изучения этих вопросов являются клеточные культуры, представляющие собой более простую по сравнению с растениями систему, выращиваемую в строго контролируемых условиях. На их примере были изучены многие аспекты биосинтеза фенольных соединений, его регуляции, в том числе и перехода к автотрофному типу питания за счет формирования в них хлоропластов [11-13]. Однако, доказательства того, что молекулы хлорофилла клеточных культур растений включены в нормально функционирующий фотосинтетический аппарат, осуществляющий перенос электрона, до настоящего времени неоднозначны. Между тем хорошо известно, что молекулы хлорофилла гетерогенны по своим функциям – одни из них включены в светособирающие комплексы не обладающие фотохимической активностью, а другие являются важнейшими компонентами реакционных центров фотосистем и непосредственно инициируют фотосинтетический перенос электрона [14]. Очевидно, что в том случае если реакционные центры ФС II и ФС I отсутствуют в хлорофилл-содержащих клетках культур in vitro, то накопление хлорофилла не является функционально значимым.
Целью настоящей работы являлось изучение накопления фенольных соединений – веществ, включенных в защиту клетки от вредного действия ультрафиолета, и фотосинтетического электронного транспорта в автотрофных участках культур тканей чайного растения, растущих на белом свету в отсутствии или в присутствии УФ лучей.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ. Каллусную культуру, инициированную из стебля чайного растения (Camellia sinensis L., грузинская разновидность), выращивали при 16-час освещении белым светом в отсутствии (контроль) или в присутствии (опыт) УФ-лучей на модифицированной питательной среде Хеллера, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (5 мг/л) и глюкозу (25 г/л) [15]. В качестве источника УФ радиации использовали лампу ДРЛФ-400 с удаленной внешней колбой, являющейся эквивалентом бактерицидной ртутной лампы высокого давления типа ПРК-2 (ДРТ). Интенсивность облучения составляла 0.74 Вт/м2 по УФ-Б по 2 часа ежедневно (с 16:00 до 18:00) в течение всего цикла культивирования.
О характере роста культур судили по изменению прироста свежей массы каллусов за определенные периоды культивирования (25, 35 и 45 дней).
Обработку метилвилогеном проводили в темноте, помещая образцы каллусов в его 1 мМ раствор на 30 мин. Флуоресценцию хлорофилла измеряли с помощью специализированного флуорометра РАМ101 ("Walz", Германия), связанного с компьютером с помощью Data Acquisition System PDA100. В начале измерения адаптированный в течение 30 мин образец освещали слабым возбуждающим светом, возбуждающим так называемую фоновую флуоресценцию, а затем либо 2-с либо 50-мс импульсом света для индуцирования переменной флуоресценции [16]. Импульс мощного белого света длительностью 2 с формировали включая и выключая с помощью фотозатвора свет от осветителя KL-1500 ("Schott", Германия). Короткую вспышку света длительностью 50 мс получали с помощью ксеноновой лампы, управляемой соответствующим источником питания ("Walz", Германия).
Фенольные соединения экстрагировали из свежего материала горячим 96%-ным этанолом. Содержание суммы растворимых фенольных соединений определяли спектрофотометрическим методом по реакции с реактивом Фолина-Дениса (поглощение при 725 нм), а содержание флаванов (сумма катехинов и проантоцианидинов) – по реакции с 1%-ным раствором ванилина в 70%-ной серной кислоте (поглощение при 500 нм) [17]. Калибровочные кривые в обоих случаях строили по (-)-эпикатехину.
В работе представлены средние арифметические значения из трех биологических повторностей (по 3-5 каллусов), проанализированных во время двух циклов культивирования, и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Каллусные культуры стебля чайного растения, растущие в условиях 16-час освещения белым светом в отсутствии (контроль) или в присутствии (опыт) УФ лучей отличались по морфологическим характеристикам. В контрольных условиях они представляли собой плотный каллус светло-желтого цвета, содержащий участки, окрашенные в зеленый цвет. К концу пассажа культуры приобретали светло-зеленое окрашивание, за счет увеличения числа клеток с хлорофиллом. Каллусы, выращиваемые в условиях действия УФ лучей, имели более плотную структуру и характеризовались интенсивным формированием хлорофилл-содержащих клеток, особенно в первой половине цикла культивирования (до 25-го дня), по сравнению с контролем
Ранее было показано, что клетки чайного растения в условиях in vitro сохраняют способность к синтезу растворимых фенольных соединений, в том числе и характерных для интактного растения флаванов [18]. Изучение динамики их образования показало, что у культур, растущих на белом свету в отсутствии УФ радиации, наибольшее накопление как суммы растворимых фенольных соединений, так и флаванов отмечалось на 25-й день культивирования. К 35-му дню роста культур оно значительно снижалось: почти на 50% в случае суммарного содержания фенольных соединений и на 35% - в случае флаванов. При дальнейшем выращивании (45-й день) значительных изменений в содержании фенольных соединений в каллусах не наблюдалось.
У культур, выращиваемых в присутствии УФ лучей, характер накопления фенольных соединений был иным: повышение содержания суммы растворимых фенольных соединений наблюдалось лишь в конце пассажа (45-й день). Что же касается содержания флаванов, то наибольшее их количество отмечено на 25-й культивирования, к 35-му дню оно снижалось почти вдвое, а к 45-му дню – вновь возрастало. Все это свидетельствует о различиях в образовании фенольных соединений у культур, растущих в отсутствии и присутствии УФ лучей. Если исходить из положения о том, что синтез фенольных соединений в клетках растений связан с функционированием в них хлоропластов [19], то важным моментом является изучение их фотосинтетической активности, на что в дальнейшем и было обращено наше внимание.
Как упоминалось выше, в каллусных культурах чайного растения, выращиваемых на белом свету в отсутствии и присутствии УФ лучей, происходило формирование клеток, содержащих молекулы хлорофилла, что может быть свидетельством их автотрофности. Однако доказательства того, что эти молекулы хлорофилла включены в нормально функционирующий фотосинтетический аппарат, осуществляющий перенос электрона, до настоящего времени отсутствовали.
Освещение интенсивным белым светом культур тканей, выращенных в отсутствие УФ лучей, вызывало лишь небольшое увеличение флуоресценции хлорофилла. Отношение переменной части флуоресценции к максимальной ее амплитуде составляло 0.19. В отличие от этого, у образцов, подвергавшихся в процессе роста действию УФ лучей, амплитуда переменной флуоресценции была значительно выше и ее отношение к максимальной амплитуде флуоресценции хлорофилла составляло 0.53, показывая более высокую активность ФС II.
Помимо различной амплитуды переменной флуоресценции хлорофилла, кинетические кривые показывают явные различия в кинетике темнового спада переменной флуоресценции, отражающей реокисление восстановленного первичного акцептора ФС II [20].
Спад переменной флуоресценции у контрольной культуры тканей представлен двумя экспоненциально спадающими компонентами. Более медленно спадающий компонент характеризовался относительной амплитудой 14% и временем полуспада 224 мс. Амплитуда быстрого кинетического компонента, характеризовавшегося временем полуспада 49 мс, была значительно выше и составляла 88%. Более сложный характер имела кинетика темнового спада переменной флуоресценции у культур тканей, выращенных в присутствии УФ лучей. У таких образцов, в этой кинетике различались три экспоненциально спадающих компонента, сходных по амплитуде, но сильно различавшихся скоростями спада. Медленный компонент характеризовался относительной амплитудой 30%, и временем полуспада 1580 мс. Средний и быстрый кинетические компоненты имели относительные амплитуды 32% и 36%, соответственно, а их времена полуспада составляли 208 и 43 мс.
Все это свидетельствует о том, что защитные механизмы активируются уже при таких уровнях УФ излучения, которые не приводят к повреждению клеток, но, по-видимому, инициируют фоторегуляторные ответы. Очевидно, что этот эффект следует принимать во внимание при рассмотрении акклиматизации растительных клеток к повышенным уровням УФ радиации.
Работа поддержана РФФИ, проект N 04-04-49408.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
|
|
Каталог 
