КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ УФ-Б-РАДИАЦИИ
П.В.Лапшин, Р.Г.Бутенко*, В.С.Шевелуха
Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева, кафедра сельскохозяйственной биотехнологии;
*Институт фзиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва, 123276, Ботаническая 35

SUMMARY

На примере двух генотипов яровой мягкой пшеницы T.aestivum (сорт "Таежная" и линия "Фотос") изучали возможность получения с помощью методов in vitro культуры клеток, обладающих повышенной устойчивостью к средневолновому ультрафиолетовому излучению в диапазоне длин волн от 280 до 320 нм (УФ-Б). В результате индивидуального отбора по признаку интенсивности прироста ткани из выборки каллусных агрегатов были выделены несколько клеточных линий, способных сохранять высокий уровень прироста каллусной массы в присутствии УФ-Б облучения. Показано, что у генотипа "Фотос" облучение в большей степени влияло на инициацию каллусов, тогда как у генотипа "Таежная" - на их рост. Жизнеспособность каллусов в значительной степени зависит от интенсивности и длительности действия этого стрессового фактора.

On an example of two genotypes of summer soft wheat T.aestivum (the Taezhnaya variety and the Fotos line) studied possibility of obtaining (with the help of an in vitro culture methods) of crates having boosted stability to a medium ultra-violet radiation in a range of lengths of waves from 280 up to 320 нм (UV-B). As a result of individual selection to characteristic of intensity of increase of a grown, from sampling of callus aggregates were selected a some cell lines, capable to save a high level of increase callus mass in presence UV-B irradiation. Is exhibited, that for a Fotos genotype the irradiation in the greater degree influenced on callus formation, whereas for a Taezhnaya genotype - on their propagation. However callus viability substantially depends on intensity and duration of operation of this stressful factor.

Изменение состояния озонового слоя Земли, являющееся следствием техногенных воздействий, привлекает пристальное внимание ученых. Отмечено снижение концентрации озона над Южным и Северным полюсами [9, 10]. Значительное утоньшение озонового слоя характерно также для тропиков Африки, Южной Америки и экваториального пояса [10, 13]. В результате этих изменений на поверхности планеты увеличивается уровень ультрафиолетового (УФ) излучения, особенно в диапазоне длин волн от 280 до 320 нм, который относится к его "среднему" или "Б"-участку и обозначается как "УФ-Б радиация" [10, 13].

Известно, что УФ-Б радиация является одним из сильных стрессовых факторов окружающей среды [1]. Под ее влиянием происходят значительные изменения в морфо-физиологических характеристиках растений. Например у пшеницы замедлялся линейный рост стебля, уменьшался коэффициент кущения и число колосоносных побегов [8], а у проростков картофеля - снижалась высота стебля и площадь листьев [11]. Причиной образования в условиях действия УФ-Б радиации растений с заторможенным ростом, плохой пигментацией и нарушениями формирования листового аппарата являются повреждения в структуре ДНК, изменения гормонального статуса растений, а также функционирования их фотосинтетического аппарата [12, 15]. Эффекты действия УФ-Б радиации зависят и от стадии роста растений. В большей степени они проявляются при переходе от вегетативной к репродуктивной стадии их развития [14].

Основной зерновой культурой сельского хозяйства России является пшеница, с которой давно ведется селекционная работа с использованием традиционных подходов. В последнее время для этих целей все более широкое применение находят и биотехнологические приемы, основанные на селекции растительных клеток в условиях in vitro [3, 4]. Такой подход существенно ускоряет селекционный процесс в силу реализации свойственной растительной клетке тотипонентности.

Целью настоящего исследования являлась селекция каллусных культур пшеницы, обладающих повышенной устойчивостью к действию УФ-Б радиации.

МЕТОДИКА

Объектом исследования являлись каллусные культуры, инициированные из двух генотипов яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum - сорт "Таежная" и линия "Фотос". Работа была выполнена на базе отдела Биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева, под руководством проф. Р.Г. Бутенко.

Сорт "Таежная" был выведен в Красноярском НИИСХ методом индивидуального отбора из третьего поколения гибридной комбинации К-441 (Л-330 х М-341). Разновидность лютесценс. Достоинством сорта является скороспелость (созревает раньше стандарта на 2-11 дней), устойчивость к полеганию (оценивается в 4,9 балла, выше стандарта на 1,3 балла) и к прорастанию на корню и в валках. Для семян этого сорта характерна высокая послеуборочная всхожесть.

Линия "Фотос" (Л 40959) была получена индивидуальным отбором из гибридной популяции от скрещивания сортов Московская 35 и Жница в Башкирском НИИЗиС. Разновидность мильтурум. По качеству зерна относится к ценным пшеницам. Линия устойчива к полеганию, среднеранняя - созревает одновременно с сортом Жница (вегетационный период - 85-90 дней). Проявляет высокую устойчивость к поражению мучнистой росой и бурой ржавчиной, пыльной головней поражается слабо. Обладает хорошей комбинационной способностью.

Для инициации каллусной ткани семена пшеницы стерилизовали 0,1% водным раствором сулемы в течение 10 минут, заливали небольшим количеством стерильной воды и через 16-24 часа вычленяли из них зародыши. Материал помещали в чашки Петри диаметром 9 см по 12-18 штук, щитком вниз, на поверхность модифицированной агаризованной питательной среды по Murashige и Scoog (1962), содержащей 2,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 10 мг/л AgNO₃ и культивировали при температуре 20-22^oС и 16-час. фотопериоде (интенсивность освещения 4000 люкс). Длительность пассажа составляла 28 дней.

Для селекции клеточных линий пшеницы устойчивых к действию УФ-Б радиации растительный материал культивировали в стеклянных чашках фирмы "Anumbra" (Германия), не пропускающих излучение ниже 280 нм. В качестве источника УФ-Б радиации использовали лампу ДРЛФ-400 с удаленной внешней колбой, являющейся эквивалентом бактерицидной ртутной лампы высокого давления типа ПРК-2 (ДРТ). Интенсивность облучения (1,66; 1,11; 0,74; 0,55; 0,46 или 0,39 Вт/м² по УФ-Б) регулировали измением расстояния чашек от лампы ДРЛФ. Длительность облучения составляло 2 часа каждый день (с 16 до 18 часов каждый день). Контрольные варианты изолировали от лампы обычным стеклом, не пропускающим ультрафиолет.

Анализировали прирост ткани путем индивидуального взвешивания каллусных агрегатов в стерильных условиях на торсионных весах в момент очередного пассирования. Результаты оценивали в конце каждого пассажа по количеству образовавшихся каллусов из первичного экспланта и по их массе, которая учитывалась индивидуально для каждого экспланта, что позволило выделить клеточные линии, ведущие свое происхождение от одного первичного экспланта.

Опыты проводили в 2 биологических повторностях. Повторяемость в опытах 50-70 кратная. В таблицах приведены фактические значения определений и их стандартные ошибки. Статистическая обработка данных проводилась по методу малых выборок [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Каллусные культуры, инициированные из двух генотипов яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum (сорт "Таежная" и линия "Фотос") не различались по морфофизиологическим характеристикам и представляли собой плотные агрегаты светло-желтого цвета, часто с выраженной внутренней структурой, которая зависела от условий культивирования, возраста культуры, частоты пассирования и индивидуальной массы каллусных агрегатов (рис.1-3).

УФ-Б радиация приводила к снижению способности к каллусоообразованию у эксплантов, и уменьшению интенсивности прироста биомассы каллусов у обоих генотипов пшеницы (табл. 1). В большей степени эта тенденция проявлялась у каллусов инициированных из линии "Фотос".

Негативное воздействие УФ-Б-радиации хорошо прослеживается в отношении прироста ткани: чем выше доза радиации, тем меньше масса каллуса. Так, при интенсивности облучения 1,66 Вт/м² - прирост массы каллуса "Фотос" составляла в среднем 51% от прирота ткани в контрольном варианте, тогда как у "Таежной" - 45%. В случае действия более низкой дозы облучения (0,74 Вт/м²) эти показатели составляли 65% и 64%, соответственно. Отрицательное воздействие УФ-радиации на растения отмечалось и авторами [5, 6, 7, 8, 12, 13, 14].

Таким образом, клетки двух генотипов пшеницы, культивируемые в условиях in vitro, отличались по реакции на действие УФ-Б-радиации. У генотипа "Фотос" облучение в большей степени влияло на инициацию каллусов, тогда как у генотипа "Таежная" - на их рост (рис. 4). При этом высокие дозы УФ-Б-радиации (1.66 и 0.74 Вт/м²) оказались летальными для обоих генотипов (рис. 5). Так, у каллуса иницированного из сорта "Таежная" после месяца культивирования в условиях облучении сохранили рост только 23% тканей, а после второго месяца культивирования они все погибали. При перенесении инициированного в условиях УФ-Б-радиации каллуса в обычные (контрольные) условия прироста биомассы также не происходило, хотя по внешнему виду каллусы сохраняли характерный для живой ткани светло-желтый цвет и рыхлую консистенцию.

В последующем условия селекции были несколько изменены - уменьшена общая доза УФ-Б-радиации и введена более дифференцированная шкала воздействия (1,11; 0,74; 0,55; 0,46 и 0,39 Вт/м²). В этом случае, после 2 субкультивирований в условиях УФ-Б-радиации (0,55 Вт/м²) получили жизнеспособные колонии (11%), которые обладали значительным приростом клеточной массы. Каллусные культуры генотипа "Фотос" оказались более устойчивыми к действию УФ-Б радиации, чем каллусные культуры генотипа "Таежная". Даже при дозе 1,11 Вт/м² они давали некоторый прирост массы (27,6% и 18,9%, после 1-го и 2-го месяца,соответственно). Все это свидетельствует о возможности получения устойчивых к действию УФ-Б радиации каллусных культур, инициированых из двух генотипов пшеницы. Однако их жизнеспособность в значительной степени зависит от интенсивности и длительности действия этого стрессового фактора. Зависимость отклика биологической системы от интенсивности действия исследуемого фактора показана и другими авторами [1, 5, 7, 14, 15].

Выводы

1. Разработана схема клеточной селекции пшеницы на устойчивость к действию УФ-Б-радиации с использованием искусственного источника излучения.
2. Показана возможность получения клеточных культур пшеницы, сохраняющих способность к росту в присутствии УФ-Б-радиации.
3. Установлена зависимость роста клеточных культур пшеницы от интенсивности и длительности действия УФ-Б радиации.

1. Акназаров О. (1976) Активность эндогенных регуляторов роста у растений высокогорий Памира // Автореф. ... уч. степ. канд. биол. наук, Душанбе.
2. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. Л., Университет. 1975. 76с.
3. Бутенко Р.Г. "Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе", Монография. 1999г., Москва, ФБК-Пресс, 1999, 159с.
4. Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro/ М 94 В сборнике
5. Жалилова Ф.Х. (1993) Влияние УФ-Б радиации на содержание фитогормонов и рост мутантных линий арабидопсиса // Автореф. ... уч. степ. канд. биол. наук, Москва.
6. Жалилова Ф.Х., Ракитина Т.Л., Леасов П.В., Кефели В.И. (1993) Действие ультрафиолетовой радиации (УФ-Б) на рост и выделение этилена из трех генетических линий Araabodopsis thaliana // Физ. раст. 40(8), 764-769.
7. Канаш Е.В. (1990) Изменение продуктивности и содерожания пигментов у растений фасоли при ультрафиолетовом стрессе. В кн. "Фотосинтез и продуктивность растений", ВАСХНИЛ, Саратов, 86-89.
8. Шульгин И.А., Забиров Р.Г., Щербина И.П., Толибеков Д. Т. (1990) О роли ультрафиолетовой радиации высокогорных районов в строении побега и продуктивности пшеницы // Биол. науки, N7, 107-118.
9. Farman J.C., Gardiner B.G., Shanklin (1985) Large losses of total ozone in Antarctica reveal seasonal ClOx/NOx intereaction //Nature, 315, 207-210.
10. Frederick J.E., Snell H.E., Haywood C. (1989) Solar ultraviolet radiation at the earths sufase //Photochem.Photobiol., 50(8), 443-450.
11. Green A.E.S., Cross K.K., Smith L.A. (1980) Improved analytical characterization of ultravioleet skylight // Photochem. Photobiol., 31(1), 59-65.
12. Iwanzik W., Tevini M. (1983) Action of UV-B radiation on photosynthetic primary reaction in spinach chloroplasts //Phys.Plant., 58(3).
13. Sisson W.B., Caldwell M.M. (1977) Atmospheric ozone depletion reduction of photosysthetic and growth of a sensitive higher plant exposed to enhanced УФ-Б radiation // Exp.Bot., 28(104), 691-697.
14. Teramura A.H., Silivan J.H. (1987) Soybean growth responses to enhanced levels of ultraviolet-B radiation under greenhouse condition //Am.J.Bot., 26, 89-95.
15. Tevini M.,Braun J.,Fieser G. (1991) The protective function of the epidermal layer of rye seedlings against ultraviolet-B radiation // Photochem. Photobiol.,53(3),329 -333.