Культивар: номер 1 (34)

КУЛЬТУРА КАКТУСОВ IN VITRO

Автор - Уна, материал с Shroomery Message Board
перевод и подготовка - Петр Лапшин

От редакции

Методы культуры тканей растений in vitro кратко можно попытаться описать таким образом, что для культивирования фрагментов растений используются очень богатые питательные среды, содержащие кроме минеральных солей, еще витамины, растительные гормоны (или их аналоги) и другие сложные органические компоненты. В обычных условиях на таких средах будет моментально поселяться микрофлора. Чтобы этого избежать, растительные ткани изолируют от окружающей среды и культивируют в стерильных условиях: в стеклянных банках, пробирках, на чашках и т.д. Отсюда происходит распространенное название метода: "культура in vitro". In vitro означает "в стекле". Механическим субстратом для растительных тканей в большинстве случаев является агар, который придает жидкой питательной среде механическую твердость, что удобно для манипуляций.

Использование сбалансированных питательных сред позволяет работать с очень маленькими фрагментами растений, которые в обычных условиях (in vivo) не выживают. Это открывает большие возможности для очень быстрого вегетативного размножения с высоким коэффициентом (теоретически до миллиона растений в год). Использование растительных гормонов или их аналогов позволяет изменять нормальную "программу" развития организма и добиваться, например, активного ветвления для побегов, не склонных к этому, получать неорганизованный рост клеточной массы без образования органов и потом получать из такой каллусной культуры массовую регенерацию и т.д.

В предлагаемом ниже материале автор Уна рассказывает о своем опыте введения в культуру in vitro вететативных частей кактусов лоф и трихоцереус. Кактусы не являются первоочередными объектами ни для промышленной биотехнологии, ни модельными объектами для фундаментальной науки, поэтому, хотя биотехнология растений как наука насчитывает уже полувековую историю, работ на кактусах in vitro не так уж много и предлагаемый материал является хорошим примером успешной работы на этих, не самых простых для техники in vitro, объктах.

Уна Это мой первый успех. Кактус "Сан-педро" образует новые точки роста в условиях in vitro (фото 1, 2).

Нейро Какая у Вас питательная среда, гормоны и их количество?

Уна Я не могу сказать Вам рецепт, но если Вы интересуетесь культурой кактусов in vitro, вот это письмо может быть очень информативным.

Тема: Рецепт для кактусов
От: "Р. Велленс"

rwellens@zeelandnet.nl

plant-tc@tc.umn.edu

ссылка

Дорогая Диана!

Нет конкретного рецепта "питательной среды для кактусов", но есть большое разнообразие условий для Cactaceae и почти каждый вид требует персонального подхода. В целом, большинство кактусов будут расти на питательной среде по рецепту Тошио Мурасиге и Фольке Скуга (MS) в концентрации 1/2, или на половинной среде "B5", с гормоном из группы цитокининов БАП (бензиламинопурин) в концентрации от 0.1 до 10 мг/л. Некоторые кактусы исключительно сложны в культуре, например холодостойкие виды из Северной Америки (Sclerocactus, Pediocactus и др.). И кактусы, подобные Ariocarpus, Aztekium и другие медленнорастущие из Мексики.

Относительно простые в культуре большинство (но не все) - Rebutia, Mammillaria, Gymnocalycium и др. Обычно они размножаются активизацией почек в ареолах. Это может быть достигнуто на среде, описанной выше в течение 2-3 недель в темноте.

Вы можете брать фрагменты кактуса с 3-4 ареолами и выращивать их в темноте на описанной среде.

Когда Вы не можете начинать стерильную культуру с сеянцев, и вынуждены работать с взрослыми растениями, Вы столкнетесь с трудностями дезинфекции первичного материала (экспланта) при введении в культуру in vitro. В этом случае мы обычно берем только верхушки побегов. Мы используем для поверхностной стерилизации 2% отбеливатель для белья, замачиваем в нем эксплант в течение часа или дольше, переодически перемешивая. Иногда добавляем поверхностно-активное вещество (средство для мытья посуды) чтобы улучшить смачивание поверхности для опушенных объектов. Но иногда все же случается развитие грибной микрофлоры даже после такой длительной стерилизации. Но как только Вы имеете чистый (не содержащий микрофлоры) большой фрагмент in vitro, Вы можете разрезать его на маленькие фрагменты для активизации ареол. Однако Вы потратите много времени, чтобы подобрать оптимальные условия для того, чтобы процесс стал действительно эффективным. Укоренение обычно не является большой проблемой. Для простых видов достаточно среды MS в половинной концентрации без каких-либо ауксинов, но в отдельных случаях такой ауксин как IBA мог бы быть полезен.

Одна из существенных проблем при работе с кактусами - витрификация (оводнение тканей). Она может быть преодолена использованием сосудов в какими-либо воздушными фильтрами (например, сосудами с горлом большого диаметра, закрытыми рыхлыми ватными пробками), однако в этом случае среда будет быстро высыхать.

Как только Вы определитесь с тем, с каким именно видом кактусов будете работать, Вам придется разрабатывать персональный протокол именно для этого вида, для чего может быть полезна общая информация, изложенная выше.

В завершении скажу, что существуют статьи, в которых описана разработанная технология для некоторых видов кактусов. В тоже время каллусная культура и эмбриогенез из каллуса пока не изучаются нами и поиск литературы об этом для кактусов пока не дает хороших результатов.

Я надеюсь, что это поможет Вам, Вы можете также найти некоторую литературу для определенных видов. Желаю успеха в Вашей работе.

Роберт Велленс (Robert Wellens)
проект "Культура суккулентов in vitro" (Succulent Tissue Culture).

DazedSol Замечательно, Уна!!! Пожалуйста держите нас в курсе за ходом Вашей работы... Очень жаль, что Вы не можете дать рецепт среды, но я понимаю, что Вы потратили много времени и денег на разработку успешной технологии. Адам.

felixhigh Очень хорошо, Уна! Не можете ли Вы дать нам больше ссылок на культуру кактусов in vitro?

Уна Питательная среда для кактусов (как и для большинства других растений) основана на минеральных солях по MS, содержит сахарозу, агар и регуляторы роста (гормоны или их аналоги). Я искала много времени в интернете информацию о культивировании кактусов in vitro, но там нет много информации на эту тему (от редакции: данная дискуссия состоялась в 2003 году, письмо Велленса датировано 2000 годом). Письмо Р.Велленса, которое я привела выше, практически суммирует всю информацию, которую я смогла найти сама.
Когда я найду время, я пойду в библиотеку аграрного университета в Wageningen, потому что я уверена, что было издано много научных статей относительно этой темы и я смогу получить их именно там.
Я изучала растениеводство 4 года и моя заключительная работа была о разработке протоколов по культуре тканей.

Уна Вот некоторые картинки: больше pachanoi - фото 3. Развитие нового побега. фото 4. Укоренение Pereskiopsis в пробирке - фото 5.

Нейро Отлично, Уна.. Вы пытались получить каллус и получить из него корни или побеги?

Agarico Можно ли делать это без использования ареол? Только из тела кактуса?

Effed Уна, Вы настоящий новатор.

Openminded Очень, очень мило. Я всегда завораживался этим видом культуры тканей. Мне нравится, когда можно просто отрезать кусочек чего-то и это вырастает в целое растение. Но это не так просто на практике... Пожалуйста держите нас в курсе относительно Ваших успехов!

Anand Уна: я не знаю, где можно получить компоненты для приготовления среды MS и другие инградиенты.

Уна Эмбрионенез из каллуса возможен у многих видов, поэтому я не вижу, почему это было бы невозможно у кактусов. Конечно, для этого необходима разработанная методика (которой у меня пока что нет). Побегам необходимо 3 недели, чтобы развиться.
Мы не будет продавать компоненты питательной среды и регуляторы роста, которые необходимы, т.к. большинство из них токсичны и требовали бы специального транспорта для доставки. Ананд, если Вы дейсвительно интересуетесь этим, Вы могли бы войти в контакт: info@labassociates.com и www.labassociates.com/.

Уна Вчера я работала с кристатным-монстрозным pachanoi.
Вот мой "ламинар": фото 6. Перед Вами банки со стерильной водой (справа), бутыль со стерилизующим агентом (спереди) и емкости с агаризованной питательной средой (слева) (от редакции: в питательную среду добавляют желирующий компонент - агар для придания ей механической твердости, чтобы эксплант не тонул в жидкости. Добавление агара эквивалентно использованию любого инертного механического носителя, как гравия или песка).
Стерилизуется большой кусок экспланта: фото 14 и 15 (жидкость для поверхностной стерилизации экспланта - бытовое средство для чистки унитазов), затем основание экспланта, поврежденное стерилизующим агентом, удаляют, а остальную часть экспланта режут на небольшие куски (фото 7, 16, 17) и раскладывают по банкам (фото 8, 10, 18) со средой, стимулирующей развитие в том или ином направлении.

Продолжение эксперимента. Фотографии сделаны через несколько недель. Я перенесла куски на свежую среду и cрезала образовавшийся каллус. Новые побеги развиваются устойчиво: фото 9. Trichocereus bridgesii теперь также показывает некоторую активность: фото 10.

Anonymous Культивирование каллуса приводит к генетическим изменениям. Это не очень хорошо для поддержания существующих культиваров, т.к. будет некоторая изменчивость, но удобно для получения новых культиваров. Для поддержания существующих культиваров перспективнее размножение пазушными почками, а не каллусом.
Исследование микроразмножения у кактусов очень ограничены. Кактусы не являются приорететным направлением для исследований. У меня есть некоторые журналы на тему микроразмножения кактусов, если Вам интересно. Выбор экспланта, каллусогез, индукция пазушных почек и соматический эмбриогенез, изучение некоторых определенных видов.

Уна фото 11. Trichocereus pachanoi: фото 12.

DazedSol Привет, Уна! Какое освещение Вы используете там, где они растут?
Adam.

Уна Они растут под обычными люминисцентными трубками (33/84 холодный, белый)

Уна Вчера я разрезала недавно сформировавшиеся побеги. Они росли в течение 2 месяцев. Каждый побег дал от 2 до 4 новых, которые были помещены на свежую среду. Это дало средний коэффициент размножения 7.
Если дальнейшее размножение будет примерно с тем же коэффициентом в течение года, очень много растений могли бы быть получены: теоретически до 16807 растений в год, начиная с одного эксплантата. Вот когда начинается действительное быстрое размножение.
Концентрация цитокинина влияет на количество побегов и количество ребер на побеге (в прямой зависимости).
Вот картинка: фото 13.

stonErollEr1 Рост мог бы быть быстрее, если свет был бы более интенсивным, например под лампами "HPS/MH"? Правильно?

Уна Вероятно, нет, количество воздуха внутри банок не позволяет активно ассимилировать. Питательная среда содержит сахарозу для снабжения всходов энергией.
Побеги также могут развиваться в темноте, но останутся белыми (желтыми).

stonErollEr1 Эта работа настолько удивительна! И очень интересно все это читать.. Большая работа Уна!

Уна Я только что получила красивый вариегатный Tr. peruvianus и не могла сопротивляться желанию ввести его в культуру. Посмотрим, как будут развиваться желтый или зеленый фрагменты...
Вот отрезок побега: фото 14. Поверхностная стерилизация в отбеливателе для белья в чашке на магнитной мешалке: фото 15. После этого следует трехкратная промывка стерильной водой. Дальше побег режем на части: фото 16 и помещаем на питательную среду: фото 17.
После размещения в банках их заклеивают (специальной восковой лентой, пищевой пленкой, фольгой, чем угодно), чтобы исключить контакт с атмосферой. В нашем случае мы использовали восковую ленту: фото 18 (а на фото 22-24 в качестве прокладки под крышкой использованы сухие гигиенические салфетки).

Вот фото 19. Вот сеянцы фото 20. Мои первые погибли, но сейчас развиваются новые побеги из большинства ареол. Размножение может быть даже выше, чем 16,000 штук от одной в год!

Ekstaza Грандиозно! Я люблю наблюдать, как люди с большим интеллектом делают великие вещи. Уна, Вы "лучший генофонд человечества". Замечательно! Удивительно! Потрясающе! Поистине выдающиеся результаты!
Да, я полагаю, что это достаточно.

Уна Есть хорошая фотография. Большнство ареол раздуваются и вырастают новые побеги. Это на неделю быстрее, чем у первоначальных эксплантов. Растения адаптировались к новым условиям: фото 21. Несколько фото 22. Еще одно маленькое добавление: фото 23.

medicinebag Какая механическая основа для культуральной среды?

Нейро Экспланты на агаре с минеральными солями и гормонами.

Уна Следующие картинки получены несколько недель спустя. Pachanoi растет очень мило в условиях in vitro: групповое фото - фото 24, крупным планом - фото 25. Каллусная культура с спонтанным формированием побегов: фото 26, общий план: фото 27.

Openminded Для всех, кто интересуется культурой in vitro посмотрите эту страницу. Может быть это будет хорошей отправной точкой. Там рецепт для типичной культуральной среды, краткое описание роли разных регуляторов роста, примеры и т.д. Конечно, эти среды не оптимизированы для кактусов, но все же я думаю, что это то, что следует прочитать...

YSr Не могли бы Вы немного познакомить с некоторыми инградиентами? Пожалуйста дайте короткое описание, что такое ИУК (IAA) и ГК (GA)...

Уна ИУК (IAA) - индолилуксусная кислота - ауксин, и ГК3 (GA3) - гиббереловая кислота. Подроно о регуляторах роста растений смотрите здесь. Регуляторы роста дают сигнал для растений развиваться по тому или иному пути: побеги, корни, каллус и т.д.
Небольшое введение в культуру тканей in vitro смотрите здесь.

YSr Есть ли у Вас еще ссылки на страницы, где можно почитать относительно разных сред для культуры тканей растений? Я очень заинтересован и не знаю, откуда начать.

Уна http://aggie-horticulture.tamu.edu/tisscult/database/media/index.html

YSr Уна, Вы можете порекомендовать какие-либо хорошие книги?

Уна YSr, смотрите вот здесь: Experiments in Plant Tissue Culture by John H. Dodds, Lorin W. Roberts

YSr Уна, что Вы думаете об этой книге? Где я могу купить гормоны? Кто-нибудь, дайте пожалуйста ссылку? Мне нужно около грамма каждого.

Нейро Такие крупные компании - поставщики оборудования и реактивов как Fischer, Sigma и другие, правда они не всегда будут работать с физическими лицами. Также смотрите фирму Phytotech labs http://www.phytotechlab.com.

YSr Имеется много разных ауксинов Какие желательно использовать? Тоже самое относительно цитокининов...

Уна Наиболее широко применяемыми цитокининами являются БАП (BAP - бензиламинопурин) и кинетин (kinetin).
Из ауксинов используют НУК (нафтилуксусная кислота - NAA), ИУК (ундолилуксусная кислота - IAA) и IBA. Такой препарат как 2,4-D (дихлорфеноксиуксусная кислота) не так часто используется, так как вызывает мутации. Хотя это зависит от целей исследования. Также 2,4-Д благодаря более "жесткому" действию часто не имеет альтернативы для ряда объектов. В качестве основной среды я бы предложила пропись по МС (Murashige & Skoog) или по Гамборгу (Gamborg B5). Важно следить за уровнем pH у сред, т.к. это очень важно. В готовой среде его корректируют 0,1 M NaOH или HCl.
Желаю удачи!

YSr Я купил обе книжки в Амазоне...

Уна

YSr

Нейро
PS. От редакции Тематика сервера www.shroomery.org (ориентирован на людей, подвинувшихся на грибках и попытках ловли кайфа с них или с чего угодно еще), с которого перенесена эта статья, накладывает свой отпечаток на объекты, которые выбраны для этой демонстрации: небезизвестный пейот и другой не менее "интересный" для тех же целей Сан-педро. В соответствующем стиле оформлен и сайт (рекламный баннер выше), псевдонимы и аватары участников обсуждения:

Ekstaza
Agarico